細(xì)胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶（CWI）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC4325

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入20 mL試劑一，充分溶解后待用；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg無水*萄糖。臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存一周。

產(chǎn)品說明：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代謝中發(fā)揮著重要作用。Inv根據(jù)最適pH，可分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI），其中AI根據(jù)亞細(xì)胞定位的差異又可分為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和細(xì)胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以離子鍵的形式結(jié)合在細(xì)胞壁上，在“庫(kù)"組織韌皮部蔗糖卸載、蔗糖質(zhì)外運(yùn)輸、植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及抵抗各種脅迫中起著重要作用。

CWI催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖，還原糖與3,5 –二硝基水楊酸反應(yīng)生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質(zhì)，通過測(cè)定540nm處吸光值變化可計(jì)算得CWI活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式低溫離心機(jī)、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g，離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL蒸餾水，充分震蕩混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL提取液二，充分混勻，4℃浸提15h，4℃，12000g，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為2、1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表 (在1.5mL離心管中操作) ：

注意：如果樣本在37℃反應(yīng)后的95℃水浴步驟中出現(xiàn)沉淀，建議室溫12000g，離心5min，取上清（若上清不足400µL，可按比例縮小加樣體系，如300µL上清+150µL試劑三）進(jìn)行下一步操作。

三、CWI活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。

2、 CWI活性的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：37℃每mg蛋白每分鐘分解蔗糖產(chǎn)生1µg還原糖為1個(gè)酶活力單位。

CWI酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T = 33.33x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：37℃每g樣本每分鐘分解蔗糖產(chǎn)生1µg還原糖為1個(gè)酶活力單位。

CWI酶活（U/g質(zhì)量）= x×V提取×10³÷W÷T = 33.33x÷W

V提?。禾崛∫憾w積，1mL；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mg = 10³µg；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

注意事項(xiàng)：

1. 當(dāng)A或ΔA超過1.5時(shí)，建議將樣本用提取液二稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 95℃水浴時(shí)EP管蓋緊，防止水分散失，待冷卻至室溫后（建議每次實(shí)驗(yàn)后冷卻時(shí)間保持一致），再進(jìn)行下一步操作，避免液體飛濺燙傷以及影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g丁香葉加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，最后取上清后按照操作步驟操作，用96孔板測(cè)得A對(duì)照管=0.358，A測(cè)定管=0.566，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8552x-0.1864，A空白管=0.068，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.566-0.358=0.208，x=（0.208+0.1864）÷0.8552=0.461，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

CWI酶活（U/g質(zhì)量）=33.33x÷W=33.33×0.461÷0.1= 153.711 U/g質(zhì)量。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0570/BC0575 中性轉(zhuǎn)化酶（NI）活性檢測(cè)試劑盒

BC2460/BC2465 植物蔗糖含量檢測(cè)試劑盒

BC4310/BC4315 蔗糖合成酶（分解方向SS-I）活性檢測(cè)試劑盒

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