吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5380

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二：易揮發(fā)試劑，用完后盡快封口放回-20℃保存。

2、 提取液的配制：根據(jù)樣本量按提取液一：提取液二=0.99mL：0.01mL（1T）的比例配制提取液，現(xiàn)用現(xiàn)配，禁止提前配制。

3、 試劑三：臨用前加入14mL試劑一，充分混勻。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)液，未用完的試劑分裝保存，-20℃可以保存2周，避免反復(fù)凍融。臨用前取50μL的2 µmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入750μL蒸餾水充分溶解，配制成0.125μmol/mL的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液待用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)是廣泛存在于原核和真核生物中的一種重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下，吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下轉(zhuǎn)化為脯*酸，并且P5CR 還被發(fā)現(xiàn)能夠在大腸桿菌中參與到硫代脯*酸(Thioproline) 的代謝過程。

硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶催化作用下脫氫，并伴隨著NAD轉(zhuǎn)化為NADH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、分析天平、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等液體：直接測定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測定)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表：

三、P5CR活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/mg prot）=(?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣 ÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=4.167×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/g 質(zhì)量）= (?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣 ÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=4.167×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)目計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/10⁴ cell）= (?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣 ÷（500÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=0.0083×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/mL）= (?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=4.167×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}: NADH標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，0.125μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.1mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；

500：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目，500萬；10³：單位換算系數(shù)，1μmol/mL=10³nmol/mL；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 如果A_測定大于1.5或者?A_測定大于0.8，可以減少樣品量或者縮短反應(yīng)時間；若?A_測定小于0.01，可以加大樣品量或者延長反應(yīng)時間至1h或者更長時間。計算公式注意同步修改

實驗實例：

1、 稱取0.0993g橙子葉片，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.413-0.324=0.089，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}- A_空白=0.609-0.363=0.246，帶入公式計算：

P5CR活性(U/g 質(zhì)量)= 4.167×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =4.167×0.089÷0.246÷0.0993=15.182 U/g

2、 稱取0.1006g小鼠腎臟組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.543-0.461=0.082，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}- A_空白=0.609-0.363=0.246，帶入公式計算：

P5CR活性(U/g 質(zhì)量)= 4.167×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =4.167×0.082÷0.246÷1.006=13.807U/g

3、 吸取0.02mL羊血清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.616-0.215=0.401，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}- A_空白=0.609-0.363=0.246，帶入公式計算： 

P5CR活性(U/mL)= 4.167×?_測定÷?_{標(biāo)準(zhǔn)}×F =4.167×0.401÷0.246=6.793U/mL

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