超氧化物歧化酶（SOD）分型活性檢測試劑盒（WST法）說明書

（測Cu-Zn、Mn、總SOD活性）

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操

貨號：BC5250

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：使用前先使用掌上離心機離心至管底再吹打混勻；

2、 試劑二工作液：根據(jù)樣本數(shù)量按試劑二：蒸餾水=5μL：395μL（共400μL，可做約4個Cu-Zn-SOD樣本或2個Mn-SOD樣本）的比例配制試劑二工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3、 試劑四工作液：根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=20μL：180μL（共200μL，約4T）的比例配制試劑四工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，根據(jù)其輔基結(jié)合金屬離子的不同，可分為銅鋅SOD、錳SOD等類型，銅鋅SOD主要位于細(xì)胞質(zhì)，錳SOD主要位于線粒體。SOD催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成H₂O₂和O₂。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

通過黃*呤及黃*呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O₂^-)，O₂^-可與WST-1反應(yīng)生成水溶性黃色甲臜，后者在450nm處有吸收峰；SOD可清除O₂^-，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液黃色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。樣本經(jīng)過處理后銅鋅SOD活性不變，錳SOD活性喪失。通過測定總SOD活性和銅鋅SOD活性，可計算得到錳SOD活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、漩渦混勻儀/振蕩器、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理

1. 總SOD活性測定

1) 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）=500-1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液一）超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g 4℃離心10min，取全部上清，部分用于測定總SOD活性。

2) 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取全部上清，部分用于測定總SOD活性。

3) 血清（漿）樣本：直接用于測定總SOD活性，若有渾濁可離心后取上清進(jìn)行測定。

2. 銅鋅SOD活性測定

1) 取上一步提取得到的上清，按照上清體積（mL）：提取液二體積（mL）=2:3的比例（建議取0.2mL上清加入0.3mL提取液二）混合，震蕩混勻1min，4000g 4℃離心10min，取最上層的上清用于測定銅鋅SOD活性，此上清即樣本處理上清，上清中銅鋅SOD活性不變，錳SOD活性喪失。

注：上清和提取液二混勻離心后分為3層，取最上層溶液測定即可。

2) 按照蒸餾水體積（mL）：提取液二體積（mL）=2:3的比例（建議取0.2mL蒸餾水加入0.3mL提取液二）混合，震蕩混勻1min，4000g 4℃離心10min，取最上層的上清用于測定銅鋅SOD活性的空白管，此上清即蒸餾水處理上清。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 測定前將試劑一、試劑三和試劑四工作液37℃保溫5min以上。

3. 樣本測定（在EP管中按順序加入下列試劑）

充分混勻，37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)30min后，置于1mL玻璃比色皿測定450nm下的吸光度，空白管1、空白管2、空白管3和空白管4只需做1-2次，每個樣本測定管需設(shè)置一個對照管。

總SOD的記為A1測定、A1對照、A1空白、A2空白，計算ΔA1測定=A1測定-A1對照，ΔA1空白=A1空白-A2空白。

銅鋅SOD的記為A2測定、A2對照、A3空白、A4空白，計算ΔA2測定=A2測定-A2對照，ΔA3空白=A3空白-A4空白。

三、 SOD活性計算

1、抑制百分率的計算：

總SOD抑制百分率=(ΔA1空白-ΔA1測定) ÷ΔA1空白×100%

銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA3空白-ΔA2測定) ÷ΔA3空白×100%

盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)，越靠近50%越準(zhǔn)確。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣本；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本或者提高加樣表中的樣本量，但需相應(yīng)減少測定管和對照管中蒸餾水的體積。注意同步修改計算公式。

2、SOD酶活性單位：在上述黃*呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位。

3、SOD酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷V樣×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD活力計算：

A 按樣本蛋白濃度計算

SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷（1-抑制百分率）×V反總]÷（V樣×Cpr）×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

B 按樣本質(zhì)量計算

SOD活性 (U/g 質(zhì)量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

C 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

SOD活力 (U/10⁴ cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)×F

=0.0222×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

（3） 錳SOD活性=總SOD活性-銅鋅SOD活性

V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本的體積，0.09mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬，F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1、 樣本和試劑二工作液使用時在冰上放置。

2、 樣本較多時，可按表格配制測定管工作液和對照管工作液（包含試劑一、（試劑二工作液）、試劑三、蒸餾水），試劑四工作液必須最后加入。

3、 本試劑盒可做24個錳-SOD樣本或者48個銅鋅-SOD樣本。

實驗實例：

1. 取0.1019g車前葉片加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋2倍，按照測定步驟操作，用玻璃比色皿

測得計算ΔA1測定= A1測定-A1對照=0.3454-0.0887=0.2567，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.7898-0.0694 =0.7204，總SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=64.367%；取0.2mL稀釋2倍的上清，加入0.3mL提取液二，按照測定步驟操作，用玻璃比色皿測得計算ΔA2測定= A2測定-A2對照=0.7646-0.0683=0.6963，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.2289-0.0580=1.1709，銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=40.533%，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

總SOD活性（U/g 質(zhì)量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =393.896 U/g 質(zhì)量

銅鋅SOD活性（U/g 質(zhì)量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =148.628 U/g 質(zhì)量

錳SOD活性（U/g 質(zhì)量）=393.896-148.628 =245.268 U/g 質(zhì)量

2. 取0.1104g兔脾臟加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋10倍，按照測定步驟操作，用玻璃比色皿測得計算ΔA1測定= A1測定-A1對照=0.3507-0.0699=0.2808，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.7898-0.0694=0.7204，總SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=61.022%；取0.2mL稀釋10倍的上清，加入0.3mL提取液二，按照測定步驟操作，用玻璃比色皿測得計算ΔA2測定= A2測定-A2對照=0.7782-0.0543=0.7239，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.2289-0.0580=1.1709，銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=38.176%，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

總SOD活性（U/g 質(zhì)量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =1575.453 U/g 質(zhì)量

銅鋅SOD活性（U/g 質(zhì)量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =621.404 U/g 質(zhì)量

錳SOD活性（U/g 質(zhì)量）=1575.453-621.404=954.049 U/g 質(zhì)量

3. 取1000萬細(xì)胞加入1mL提取液一進(jìn)行前處理并按測定步驟操作，反應(yīng)體系中樣本量加倍，用玻璃比色皿測得計算ΔA1測定= A1測定-A1對照=0.3761-0.1271=0.2490，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.8318-0.0608=0.7710，總SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=67.704%；取0.2mL上清，加入0.3mL提取液二，按照測定步驟操作，用玻璃比色皿測得計算ΔA2測定= A2測定-A2對照=0.5994-0.0590=0.5404，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.0406-0.0545=0.9861，銅鋅SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=45.201%，修改計算公式后按細(xì)胞數(shù)量計算酶活得：

總SOD活性（U/10⁴ cell）=0.0056×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =0.012 U/10⁴ cell

銅鋅SOD活性（U/10⁴ cell）=0.0056×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =0.005 U/10⁴ cell

錳SOD活性（U/10⁴ cell）=0.012-0.005=0.007 U/10⁴ cell

參考文獻(xiàn)：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

[3] Cristiana, F, Elena, A. and Nina, Z. Superoxide Dismutase: Therapeutic Targets in SOD Related Pathology[J]. Health, 2014, 06(10):975-988.

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