北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學(xué)試劑及試劑盒領(lǐng)域
服務(wù)熱線：18101056239
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產(chǎn)品型號：BC5040-50T/24S
更新時間：2024-07-07
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問 量 ：935
010-50973130
產(chǎn)品分類
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α-甘露糖苷酶(α-man)活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5040
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前每支加入1mL 試劑四溶解，溶解后的試劑在-20℃分裝保存，可以保存4周。
2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5mmol/L的對硝 基苯*標(biāo)準(zhǔn)液。
產(chǎn)品說明：
α-man分布廣泛、種類繁多，在真核生物胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體中都有發(fā)現(xiàn)，不同種類、功能的α-man共同參與N-聚糖的修飾過程。
α-man和特定底物發(fā)生反應(yīng)，其生成物在405nm處有特征吸收峰，根據(jù)吸光度的變化率可計算出α-man活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、勻漿器/研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后12000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
2、細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細(xì)胞或細(xì)菌加入1 mL提取液）進(jìn)行提取，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后12000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。若有渾濁可以離心后測定
二、測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至405 nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將5mmol/L的對硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0.005mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、 操作表：(在1.5 mL離心管中)
試劑名稱（µL） | 測定管 | 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 125 | 125 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | - | - | 125 | - |
試劑一 | 550 | 625 | 625 | 625 |
試劑二 | 75 | - | - | - |
蒸餾水 | - | - | - | 125 |
混勻，37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min | ||||
試劑三 | 250 | 250 | 250 | 250 |
混勻，測定405 nm處吸光值A，分別記為A測定管、A對照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計算ΔA=A測定管-A對照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個測定管需設(shè)一個對照管，標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白管只需檢測1-2次。 | ||||
三、α-甘露糖苷酶(α-man)活性計算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y＝kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mmol/L，即μmol/mL）。
2、 α-甘露糖苷酶活性的計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）= x× V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr ×F
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/g質(zhì)量）= x× V樣÷（W×V樣÷V提?。?/span>÷T×F= x×0.1÷W×F
（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算
酶活定義：每104個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/104 cell）= x× V樣÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V提取）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷T×F
= x×0.1÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個）×F
（4）按液體體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝基 苯*為1個酶活力單位。
α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V樣÷V樣÷T×F= x×0.1×F
V提?。禾崛∫后w積，1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.125 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，10 min； F：稀釋倍數(shù)。
注意事項：
1、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測定。
實驗實例：
1、 稱取0.1 g兔子肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，12000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用1mL玻璃比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.404-0.309=0.095，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.0294x+ 0.0092，計算x=0.0422，按公式計算活性：
α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0422U/g質(zhì)量
2、 稱取0.1 g草莓果肉，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，12000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用1mL玻璃比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.113-0.091=0.022，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.0294x+ 0.0092，計算x=0.0063，按公式計算活性：
α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0063 U/g質(zhì)量
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