人白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒

注意事項(xiàng)：

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄。

3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。

5. 為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請(qǐng)離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請(qǐng)用移液器小心吹 打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。

8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示： 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試 劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請(qǐng)按國家生物 實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
 

試劑盒組成及儲(chǔ)存：

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購）

1． 酶標(biāo)儀（主波長450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機(jī)或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等 
 

人白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒

樣本收集及儲(chǔ)存：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入

2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），保存過程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混 合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測(cè)結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高 于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè)，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
 

人白細(xì)胞介素6

試劑準(zhǔn)備：

1. 試劑回溫：先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度 進(jìn)行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62 pg/ml進(jìn)行稀釋。500pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn) 濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml） 未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍 應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

IL-6 Human ELISA Kit結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm波長測(cè)定 OD 值。選擇雙波長檢測(cè)，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測(cè)，請(qǐng) 用 450 nm 的 OD 測(cè)定值減去 630 nm 的 OD 測(cè)定值。

2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中TNF-α含量可通過對(duì)應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù).
 

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2. 靈敏度： 低可檢測(cè)人 TNF-α濃度達(dá) 8pg/ml， 20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度。
3. 特異性： 不與人 TNF-β，GM-CSF，s TNFRI，s TNF RII 反應(yīng)，小鼠 TNF-α，s TNF RI
4. 重復(fù)性： 板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率： 在選取的健康人血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 TNF-α，計(jì)算回收率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 TNF-α，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀 釋，評(píng)估線性.

參考文獻(xiàn)：

1. Hirano, T. et al. (1984) J. Immunol. 133:798.
2. Kikutani, H. et al. (1985) J. Immunol. 134:990.
3. Hirano, T. et al. (1986) Nature 324:73.
4. Haegeman, G. et al. (1986) Eur. J. Biochem. 159:625.
5. Van Snick, J. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18:193.
6. .Lotz, M. et al. (1988) J. Exp. Med. 167:1253.
7. Hirano, T. et al. (1990) Immunol. Today 11:443.
8. Hirano, T. et al. (1990) in Peptide Growth Factors and their Receptors I, Sporn, M.B.and A.B.Roberts eds., Springer-Verlag, New York, p. 663.
9. Kishimoto, T. et al. (1992) Science 258:5593.
10. Hirano, T. (1992) Clin. Immunol. Immunopathol. 62:S60.
 

常見問題及解決方法：

 參考文獻(xiàn)：
《iTRAQ‐Based Proteomic Analysis Exploring the Influence of Hypoxia on the Proteome of Dental Pulp Stem Cells under 3D Culture》 作者:Lei Dou  Qifang Yan  Panpan Liang  Pengfei Zhou  Yan Zhang  Ping Ji 期刊:Proteomics 影響因子:3.106 PMID:29327447
《Some cardiac marker levels and cytokines in diabetic patients》 作者:Esmail S. Kakey and Shahen S. Hussen 期刊:International Conference on Pure and Applied Sciences 影響因子: PMID:
《Effect of blood purification on serum miR-126 and VEGF levels in the process of atherosclerosis in uremic patients under maintenance hemodialysis》 作者:Dong Zhao,Hong Shao 期刊:The Kaohsiung Journal of Medical Sciences 影響因子:1.291 PMID:30041762
《Release of mitochondrial DNA correlates with peak inflammatory cytokines in patients with acute myocardial infarction.》 作者:Chaoyi Qin, Jun Gu, Ruiqi Liu, Fei Xu , Hong Qian, Qian He, Wei Meng 期刊:Anatol J Cardiol 影響因子:1.112 PMID:27721319